Evaluación del extracto metanólico de la planta Ibervillea Sonorae en la respuesta inflamatoria inducida por eosinofilos y linfocitos Th2 a través de citometría de flujo
Morales Chávez Sergio Daniel.

INTRODUCCION
Los estudios de las vías respiratorias inflamadas, han revelado la acumulación de un gran número de células inflamatorias, incrementando l a producción de moco que recubre las vias. Notablemente la inflamación crónica conduce a cambios estructurales en el tracto respiratorio las cuales alertan una hiperreactivacion de celulas en la enfermedad.
Las enfermedades más características son, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), el asma y el enfisema pulmonar (EP).
Enfermedad pulmonar obstructiva crónica
La EPOC caracterizada por la limitación del flujo aéreo, se ha convertido en una causa mayor de mortalidad en países desarrollados. Esta enfermedad actualmente se define como una enfermedad prevenible y tratable, caracterizada por una limitación progresiva al flujo aéreo que no es totalmente reversible, aunque puede tener variaciones en su intensidad. Esta enfermedad es causada por una inflamación pulmonar secundaria a la inhalación de partículas y gases tóxicos, en especial el humo del cigarrillo.
Si bien es una afección básicamente pulmonar, en estadios avanzados presenta manifestaciones sistémicas. En estas circunstancias el enfermo se debilita, aumenta la morbilidad y disminuye la calidad de vida.
La EPOC representa la cuarta causa de muerte después de las enfermedades cardiacas, cáncer y accidentes vasculares encefálicos y tiene una morbilidad que ocupa el duodécimo de frecuencia en el mundo actual.
Enfisema pulmonar
El EP se define en términos anatómicos como la dilatación anormal y permanente de los espacios aéreos dístales al bronquiolo terminal con destrucción de sus paredes y sin signos de fibrosis. Clínicamente la disnea es el síntoma principal. Coexiste frecuentemente con la bronquitis crónica como un síndrome común denominado EPOC, siendo difícil o imposible determinar la relativa importancia de cada una en un paciente dado.
Una sustancia que existe naturalmente en los pulmones, llamada alfa 1 antitripsina, puede proteger contra este daño, por lo cual las personas con deficiencia de alfa 1 antitripsina están en mayor riesgo de contraer la enfermedad. El consumo de cigarrillos es la causa más común del enfisema. Se cree que el humo del tabaco y otros contaminantes causan la liberación de químicos desde los pulmones que dañan las paredes alveolares. El daño empeora con el paso del tiempo, afectando el intercambio de oxígeno y dióxido de carbono en los pulmones.
ANTECEDENTES
Varias células pueden ser consideradas claves en la inflamación crónica bronquial. Sin embargo, la interacción de linfocitos T y eosinófilos en la inflamación de las vías respiratorias (principalmente en el asma) parece ser de particular importancia.
Linfocitos T activados
La activación de los linfocitos T se produce tras el reconocimiento por parte del TCR/CD3 (receptor de celulas T) de la molécula HLA (Antiegeno leucocitario humano) y el péptido presentado por la misma junto con otros procesos, como son la activación de ciertas moléculas accesorias presentes en su membrana. También en este proceso de activación se hace mas eficiente si los linfocitos reciben el estimulo de ciertas citocinas mediante su unión a los receptores específicos presentes también en la membrana de estos linfocitos.

Una vez activados los linfocitos T, estos prioritariamente producirán citocinas o actores citotóxicos, según se trate de linfocitos T CD4+ o CD8+. De esta manera se desarrollará la respuesta inmune. Los linfocitos T CD4+ colaborarán en la posterior activación de otras células, tales como NK, T CD8+, linfocitos B o macrófagos. A su vez los linfocitos T CD8+ tras su activación ejercerán su función citotóxica destruyendo células blanco

Marcadores

En las investigaciones celulares se ha demostrado que un marcador de la activación de linfocito es el CD69 en activación temprana y el CD25, HLD-DR en la activación tardía. Una vez reconocido el antígeno por la célula T, estas células son capaces de diferenciarse en poblaciones TH1 y TH2; los linfocitos TH2 elaboran IL4, un esencial cofactor para la producción de IgE, e IL5, una citocina que activa la diferenciación terminal del eosinófilo y su activación.
Eosinofilo
El eosinófilo es un leucocito granulocito pequeño derivado de la médula ósea, tiene una vida media en la circulación de 3 a 4 dias antes de migrar a los tejidos en donde permanecen por varios días. Su desarrollo en la médula ósea es estimulado por la interleucina-5, la interleucina-3 y el factor estimulante de colonias granulocito-macrófago. Los gránulos están formados por un núcleo electrodenso rodeado por una matriz electrotransparente y contienen cuatro clases principales de proteínas: proteína básica mayor (MBP), proteína catiónica del eosinófilo (ECP), peroxidasa del eosinófilo (EPO) y neurotoxina derivada del eosinófilo (EDN).
Pepel del eosinofilo en las alergias
Los eosinófilos pueden regular la respuesta alérgica y las reacciones de hipersensibilidad mediante la neutralización de la histamina por la histaminasa y a su vez producir un factor inhibidor derivado de los eosinófilos para inhibir la desgranulación de las células cebadas o de los basofilos, que contienen sustancias vasoactivas.
Marcadores de eosinofilos
El CD48 es una proteína de anclaje (glicosilfosfatidilinositol) derivada de la subfamilia del CD2. Esta expresada en muchas células hematopoyéticas asociada a la membrana o en vía libre. Es de baja afinidad al ligando CD2 que esta implicada como un importante coestimulador en la activación linfocitica. El CD48 tiene gran afinidad al ligando 2B4 las cuales pueden modular las células T, células B y NK. Esta CD puede expresarse en mayor proporción en la membrana del oesinofilo activado durante el proceso inflamatorio de las vías respiratorias independientemente de la IL-4.
Ibervillea Sonorae
El Warequi (Ibervillea sonorae) pertenece a la familia de las cucurbitaceas, es una planta rastrera o trepadora de raíz abultada con aspecto de jícama. Es nativa del desierto de Sonora y utilizada por algunos grupos indígenas del noroeste de México por sus propiedades curativas.
En el estado de Sonora algunos grupos étnicos como los Mayos, Opatas, Seris y los Yaquis usan la raíz para múltiples propósitos, tratamiento antireumatico, dermatitis, antiinflamatorio, analgésico, enfermedades cardiacas, antidiabético.
Ibervillea sonorae contiene importantes cantidades de de compuestos polihidroxifenolicos de tipo flavonoides. Los compuestos de flavonoides tienen efectos antiinflamatorios y antialérgicos.
HIPOTESIS
Actividad antiinflamatoria de la planta Ibervillea sonorae en la inflamación de las vías respiratorias en pacientes asmáticos.
OBJETIVO GENERAL
Evaluar la actividad de la planta Ibervillea sonorae en respuesta a la inflamación inducida por los eosinofilos y linfocitos en pacientes asmáticos a través del clitómetro de flujo.
OBJETIVOS PARTICULARES
· Obtener el extracto puro de la planta Ibervillea sonorae
· Inducir inflamación en las vías respiratorias de ratones BALB/c
· Obtener muestra de lavado broncoalveolar
· Marcación de células con mAb


MATERIALES Y METODOS
Extracción de la planta Ibervillea sonorae
1. Recolección de la planta en el noroeste de sonora
2. Secado al aire libre en la sombra de las raíces
3. Pulverización en el molino (Muliplex)
4. Extracción de componentes en metanol durante 10 días a temperatura ambiente
5. Obtención del extracto metanolico por decantacion
6. Procesar el extracto en rotavapor (yamato) a temperatura entre 40 y 50 ºc, con una rotación de 80 – 85 rpm y con una presión de 750 kPa
7. Colocar en campana para la evaporación del metanol sobrante
8. Diluir en distintas concentraciones (variable)

Evaluación de la reacción inflamatoria
1. Inducción de inflamación de las vías respiratorias con OVA (ovalbumina) en los ratones BALB/c. (proceso variable)
2. Obtener muestra por lavado broncoalveolar de los ratones BALB/c
3. En una alícuota colocar 2X105 células con los anticuerpos anti CD65,CD25 y CD48 marcados con isotiocianato de fluoresceína.
4. En otra alícuota colocar la misma cantidad de muestra con el extracto de Ibervillea sonorae y los anticuerpos correspondientes.
5. Prueba in vivo, administración de Ibervillea sonorae al raton, obtener un lavado bronquial y analizar las distintas estirpes celulares por el citometro de flujo