ADENOSIN DESAMINASA COMO NUEVO MARCADOR PARA EL DIAGNOSTICO DE TUBERCULOSIS PLEURAL
UNIVERSIDAD DE SONORA
Alejandra Grajeda García

ResumenLa Tuberculosis Pleural es un tipo de tuberculosis, relativamente frecuente estando ligada a la alta prevalencia. El diagnostico de tuberculosis pleural es un problema clínico común, costoso y de larga duración. Este es de suma importancia sobre todo en países en donde hay mayor incidencia de esta patología.El diagnóstico se resuelve a través de una punción pleural así como la Biopsia Pleural para el estudio histológico y microbiológico, en el cual se realiza un cultivo del esputo, y del Líquido Pleural estas pruebas no son prácticas en el sentido clínico, debido a que son de larga duración. Por lo que no ayudan a tomar una oportuna y adecuada decisión terapéutica, es por eso que hay nuevas pruebas diagnósticas más rápidas y con la misma certeza.

INTRODUCCION
La tuberculosis pleural (TBP) es relativamente frecuente, estando ligada a la prevalencia de la tuberculosis (TB) de cada región; mientras se observa con frecuencia en los países más pobres, se transforma en una rara entidad clínica en los países desarrollados (9).

La tuberculosis pleural se debe a una infección por el bacilo Mycobacterium tuberculosis(1). La Mycobacteria invade la cavidad pleural principalmente por la ruptura de subpleura dañada dentro de las 6 a 12 semana después de una infección primaria. Las proteínas del bacilo parecen inducir una reacción de hipersensibilidad retrasada que estimula a linfocitos y a su entorno libera ciertas linfoquinas que: activan macrófagos contra Mycobacterium, cambian la permeabilidad de los vasos pleurales y afecta la formación de granulomas.

El derrame pleural tuberculoso es una pleuritis granulomatosa aguda causada por la infección reciente de la mycobacteria (4). El 80-90% de los derrames pleurales que se detectan en pacientes entre 15 y 30 años son de origen tuberculoso. (9)
El diagnostico de este es un problema clínico común y de mayor importancia debido a su prevalencia, el diagnostico de la tuberculosis pleural se resuelve a través del estudio histológico, punción pleural para su previo cultivo microbiológico, combinados con el cultivo de liquido pleural y esputo
El diagnóstico del derrame pleural tuberculoso deja un desafío clínico. Las pruebas de tuberculina son inespecíficas e insensibles. Por consiguiente, los cultivo de biopsia de la pleura y líquido pleural son regularmente, negativos (1)
El estándar de oro para el diagnóstico de tuberculosis es la identificación del bacilo. Sin embargo, el cultivo de Mycobacterium, consume mucho tiempo y no es bastante sensible. Los cultivos son positivos sólo en un tercio de muestras de fluidos pleurales y alrededor de dos tercios de especímenes de biopsia pleural. La presencia de granulomas sobre el espécimen de biopsia pleural es aceptada como diagnóstico.
El diagnóstico de tuberculosis pleural ha mejorado por el empleo de marcadores bioquímicos, que son más rápidos y pueden ser más sensibles. La enzima Adenosina deaminasa es uno de los mejores, proporciona la base confiable para una decisión de tratamiento en tuberculosis., sin embargo también se ve elevada en muchas otras condiciones como, empiemas, enfermedades reumatoides y desórdenes linfoproliferativos. (2)
ADA es una enzima involucrada en el catabolismo de las purinas y está presente en abundancia en los linfocitos. Está relacionada con la diferenciación y proliferación linfocitico y aumenta durante la respuesta antigénica (1). Es una enzima importante que cataliza la deaminación de adenosina y deoxyadenosina en inosina y desoxyinosina. Esta conversión es un paso inicial de una serie de reacciones responsables de la proliferación y diferenciación de linfocitos. Por lo tanto, es considerada un indicador de inmunidad celular.
Es importante recordar que ADA está presente en todas las células y a pesar del gran número de estudios realizados hasta el momento, el papel fisiológico que juega en los diferentes tejidos no es aún claro. (3)
La Adenosina deaminasa (ADA) ha ganado popularidad como una prueba diagnóstica para la tuberculosis pleural, sobre todo en países donde el predominio de TB es alto. La prueba es barata y fácil para medir (1).La determinación de ADA se realiza por un método colorinetrico de Giusti y Galanti el calcula la actividad del ADA mediante la determinación de la inosina liberada en la reacción de desaminación a través de una serie de reacciones enzimáticas acopladas (5).

MATERIALES Y METODOS
Método colorimétrico (Giusti y Galanti).

Reactivos
1.- Fosfato de sodio dehidrogenado NaH2PO4.H2O
2.- Fosfato de Sodio Dibásico anhidro Na2HPO4
3.- Adenosina
4.- Fenol
5.- Nitroprusiato de Sodio Na2(Fe[CN]NO).2H2O
6.- Hipoclorito de Sodio
7.- Hidróxido de Sodio 1N
8.- Sulfato de amonio (NH4)2SO4


Preparación de Reactivos.

Las soluciones se deben preparar con H2O bidestilada, libre de NH4. El amonio puede ser removido con la adición de H2SO4 y KMnO4.
1.- Buffer de Fosfato (50mM; pH 6.5)
Disolver 4.73 gr de NaH2PO4.H2O y 2.228 gr de Na2HPO4 anhidro en agua destilada, aforar a 1000 ml con agua destilada hervida.

2.- Solución de Buffer de Adenosina (adenosina 21mM, fosfato 50 mM, pH 6.5).
Agregar 15 ml del Buffer de fosfato (1) a 140 mg de Adenosina, disolver, aforar a 25ml en un matraz volumétrico con el mismo buffer de fosfato, colocarlo en baño maría y después enfriarlo con agua de la llave. Finalmente, ajustar el pH a 6.5

3.- Solución Stock de Sulfato de Amonio (15mM)
Disolver 1.982 gr de sulfato de amonio anhidro en agua destilada libre de amonio, aforar a 100 ml y mezclar vigorosamente.

4.- Solución Standard de Sulfato de Amonio (75µM; 0.15µval; NH3/mL)
Diluir 0.5ml de la solución stock (3) en el 100ml con buffer de fosfato (1)

5.- Solución de Fenol/Nitroprusiato (Fenol 106 mM; Nitroprisiato de sodio 0.17 mM).
Disolver 10 gr de Fenol y 50 mg de Nitroprusiato de Sodio en 500ml de agua destilada y aforar a 1000ml.

6.- Solución de hipoclorito alcalino (11mM NaOCl; 125 mM NaOH).
Mezclar 125 ml de NaOH 1N y 13.6 ml de clorox al 6%, aforar a 1000 ml con agua destilada o 14.9 ml de clorox al 5.5%


Las soluciones 1, 3, 4, 5 se colocan en frascos ámbar. Se almacenan de 0-4 ºC siendo estables por 2 meses, excepto la solución de Adenosina que se tiene que preparar diariamente (56mg de adenosina en 10 ml de solución buffer de fosfato).


Muestra
Se recolectan muestras de pacientes con tuberculosis diagnosticada para un control positivo y muestras de pacientes con otro tipo de derrame pleural (como insuficiencia cardiaca,fallo renal, cáncer de pulmon, etc.) para un control negativo.

Procedimiento
Se utiliza un espectrofotómetro para el análisis de Adenosín Deaminasa (ADA) en líquido pleural siguiendo los siguientes parámetros.

Longitud de onda: 620-650 nm
Longitud de onda óptima: 628 nm
Volumen de incubación: 1.05 ml
Temperatura de incubación: 37ºC
Volumen final: 7.05 ml
Se lee contra blanco reactivo, ajustado previamente con blanco de agua.







Pipetear en tubos:
Blanco reactivo
Estándar
Blanco problema
Problema
Buffer de fosfato (1)
1.0 ml
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Solución Buffer de Adenosina (2)
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1.0 ml
1.0 ml
Solución estándar Sulfato de Amonio (4)
----
1.0 ml
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Problema (Líquido pleural)
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----
0.05 ml
Agua destilada
0.05 ml
0.05 ml
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Se mezclan y tapan los tubos con parafilm y se incubaron por 60 min a 37ºC en baño maría.
La adición de agua destilada puede ser omitida sin provocar ningún error apreciable.

Solución de fenol/nitroprusiato (5)
3.0 ml
3.0 ml
3.0 ml
3.0 ml
Problema (Líquido pleural)
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----
0.05 ml
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Solución hipoclorito alcalino (6)
3.0 ml
3.0 ml
3.0 ml
3.0 ml

Se incuba 30 min a 37ºC en baño maría y se leyó absorbancia contra blanco reactivo.

BIBLIOGRAFIA

(1) Y. C. Gary Lee, MBChB; Jeffrey T. Rogers, RRT. Adenosine Deaminase
Levels in Nontuberculous Lymphocytic Pleural Effusions. Oficial publication of the American Collage of Chest Physicians. Septiembre, 2000

(2) Denise Duprat Neves, Ricardo Marques Dias and Antônio José Ledo A.
da Cunha. Predictive Model for the Diagnosis of Tuberculous Pleural Effusion. The Brazilian Journal of Infectious Diseases, Rio de Janeiro, RJ, Brazil. 2007;11(1):83-88.

(3) Felipe Francisco Tuon, Vivian Iida da Silva. The Usefulness of Adenosine
Deaminase in the Diagnosis of Tuberculous Pericarditis. Rev. Inst. Med. trop. S. Paulo 49(3):165-170, May-June, 2007

(4) Luis Valde´s, MD; DavidA´ lvarez, MD. Tuberculous Pleurisy A Study of
254 Patients. Arch Intern Med. 1998;158:2017-2021

(5) Cecilia Coitinho, Rosario San Martín. Utilidad de la dosificación de
adenosin deaminasa en el diagnóstico de la tuberculosis pleural.
(6) Manuel Haro, Juan Ruiz Manzano, Josep Morera. Análisis de 90 casos de
tuberculosis pleural en relación a los valores de la adenosina desaminasa.

(7) Kent D. Miller, PhD, MD; Randal Barnette, Stability of Adenosine
Deaminase During Transportation. Saint Thomas Foundation. Abril, 2004

(8) Denise Duprat Neves, Ricardo Marques Dias. Predictive Model for the
Diagnosis of Tuberculous Pleural Effusion. The Brazilian Journal of Infectious Diseases 2007;11(1):83-88.

(9) http://www.saludalia.com/docs/Salud/web_saludalia/temas_de_salud/doc/respiratorio/doc/doc_derrame_pelural.htm
(10) Fidel Camacho Durán, MD, FAC. Capitulo XXII. Derrame Pleural. Universiddad El Bosque. Fundación Santa Fe de Bogotá.